Number of the records: 1
Měření aktivity enzymů pomocí hmotnostní spektrometrie MALDI-ToF
Title statement Měření aktivity enzymů pomocí hmotnostní spektrometrie MALDI-ToF [rukopis] / Jan Strnad Additional Variant Titles Měření aktivity enzymů pomocí hmotnostní spektrometrie MALDI-ToF Personal name Strnad, Jan, (dissertant) Translated title Measuring enzyme activity using MALDI-ToF mass spectrometry Issue data 2023 Phys.des. 107 s. (195 000 znaků) : il., grafy, schémata, tab. Note Oponent Lenka Luhová Ved. práce Marek Šebela Another responsib. Luhová, Lenka (opponent) Šebela, Marek, 1971- (thesis advisor) Another responsib. Univerzita Palackého. Katedra biochemie (degree grantor) Keywords MALDI ToF * enzymová aktivita * aminoxidasa * Pisum Sativum * měření aktivity * MALDI ToF * enzyme activity * amine oxidase * Pisum Sativum * measurement of activity Form, Genre diplomové práce master's theses UDC (043)378.2 Country Česko Language čeština Document kind PUBLIKAČNÍ ČINNOST Title Mgr. Degree program Navazující Degree program Biochemie Degreee discipline Biochemie book
Kvalifikační práce Downloaded Size datum zpřístupnění 00280679-143491721.pdf 0 4.4 MB 25.04.2023 Posudek Typ posudku 00280679-ved-244141720.pdf Posudek vedoucího 00280679-opon-262468967.pdf Posudek oponenta Průběh obhajoby datum zadání datum odevzdání datum obhajoby přidělená hodnocení typ hodnocení 00280679-prubeh-772657425.pdf 14.10.2021 25.04.2023 23.05.2023 A Hodnocení známkou
Cu-dependentní aminoxidasy jsou enzymy, jež se účastní mnoha důležitých biologických procesů, mezi něž patří například regulace buněčného růstu, dělení, programované buněčné smrti a odezvy na stresory v prostředí. Přirozenými substráty jsou např. putrescin, kadaverin a spermidin. Aktivita aminoxidas je obvykle měřena spektrofotometrickými, radiometrickými, elektrochemickými či fluorimetrickými metodami. Cílem této práce bylo vytvořit metodu měření aktivity pomocí MALDI ToF hmotnostní spektrometrie na základě signálů substrátu a produktu naměřených se vzorky reakční směsi. Pro tento účel byla použita aminoxidasa purifikovaná ze semenáčků hrachu setého (Pisum sativum). Pomocí metody, jež využívala -kyano-4-hydroxyskořicovou kyselinu s přídavkem cetrimoniumbromidu jako matrici, byly určeny kinetické parametry kcat a Km pro oxidační deaminaci vybraných substrátů, a to na základě závislosti poměrů intenzit signálů produktu a produktu plus substrátu na koncentraci substrátu. Výsledky byly porovnány s paralelním měřením pomocí spektrofotometrické metody využívající spřažené reakce s křenovou peroxidasou a guajakolem a diskutovány s použitím údajů z literatury a databáze BRENDA. Bylo zjištěno, že metoda poskytuje výsledky přesné, jež však nemusejí být správné. Hodnoty Km řádově souhlasily se spodními hranicemi rozsahů uváděných v literatuře, oproti srovnávacímu spektrofotometrickému měření byly nižší. Byl navržen postup zdokonalení metody. Mezi výhody metody patří nízká spotřeba vzorku a náklady na spotřební materiál a to, že na rozdíl od metod používajících MALDI ToF malých molekul bez využití cetrimoniumbromidu nevyžaduje specifický poměr matrice a analytu. Mezi nevýhody patří to, že metoda je založena na relativní kvantifikaci a že může poskytovat horší výsledky při vysokých koncentracích substrátu.Cu-dependent amine oxidases are enzymes, that are part of many fundamental biological processes, among which belong for example regulalation of cell growth, division, programmed cell death and of reactions to enviromental stressors. Examples of natural substrates are putrescine, cadaverine and spermidine. Activity is usually measured using spectrophotometric, radiometric, electrochemical or fluorimetric methods. The aim of this thesis was to create a method of activity measurement using MALDI ToF mass spectrometry based on signals of substrate and product measured with samples of reaction mixture. For this purpose was used amine oxidase purified from garden pea (Pisum sativum) seedlings. Using a method, that utilizes -cyano-4-hydroxycinnamic acid with added cetrimonium bromide as matrix, kinetic parameters kcat a Km were measured for oxidative deamination of selected substrates, based on the dependence of ratio of intensities of signals of product and of product plus substrate on substrate concentration. Results were compared with parallel measurement using spectrophotometric metod utilizing coupled reaction with horseradish peroxidase and guiacol and discussed with data from literature and BRENDA database. The tested method provides data, that are precise, but may not be accurate. The order of measured Km values was on par with lower ends of ranges found in literature. Values were lower than those measured using spectrophotometric method. Improvement of method was suggested. Advantages of this method include low sample ammount requirements, low cost of consumables and compared to methods using MALDI ToF of small molecules without the use of cetrimonium bromide no specific matrix to analyte ratio requirements. Disadvantages include, that the method is based on relative quantification and may produce skewed results at high substrate concentrations.
Number of the records: 1