Předložená disertační práce se zabývá vývojem a validací analytických metod vhodných pro speciační analýzu chromu v biologických vzorcích. Vzhledem k tomu, že doposud nebyly v této oblasti detailně popsány aplikace on-line speciačních technik, byla speciační analýza realizována s využitím dvou módů vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) ve spojení s hmotnostní spektrometrií s indukčně vázaným plazmatem (ICP-MS). Teoretická část se detailně věnuje chromu a zejména jeho speciím Cr(III) a Cr(VI) (je zde uvedena jejich toxikokinetika, metabolismus a výskyt v biologických vzorcích). Další část popisuje přístupy ke speciační analýze chromu, součástí je i rešerše zaměřená na aplikace na různé biologické materiály. Poslední část zmiňuje instrumentaci ICP-MS, riziko možných polyatomických interferencí spojené s použitím tohoto detektoru a také komplikace s validací speciačních analýz. Experimentální část je rozdělena do dvou hlavních okruhů. První je zaměřen na vývoj a validaci speciační analýzy využívající iontově-párovou HPLC na reverzních fázích ve spojení s ICP-MS detekcí a její aplikaci na analýzu reálných vzorků krve a kloubních výpotků. Celý analytický postup byl optimalizován a validován v rozsahu linearity, meze detekce, meze stanovitelnosti, preciznosti a pravdivosti. K analýzám byly vybrány vzorky krve a kloubních výpotků odebraných od pacientů s implantovanými kovovými kloubními náhradami obsahujícími chrom. Ze získaných výsledků vyplývá, že hlavní specií uvolňovanou do krve i kloubního výpotku je Cr(III). Naopak Cr(VI) byl stanoven ve všech vzorcích pouze ve stopových koncentracích. Dále byla potvrzena vysoká afinita Cr(III) k proteinům v matrici, což značně ztěžuje jeho stanovení pomocí HPLC-ICP-MS. Všechny výsledky byly navíc statisticky porovnány s kontrolní skupinou, významně vyšší koncentrace všech forem chromu byly nalezeny pouze ve vzorcích kloubních výpotků. Podstatnou součástí bylo i studium polyatomických interferencí negativně ovlivňujících stanovení chromu pomocí ICP-MS. Druhá část práce se věnuje vývoji a validaci analytického postupu využívajícího technik iontově-výměnné HPLC-ICP-MS a ICP-MS sloužících pro stanovení všech forem chromu v biologických tkáních. Po optimalizaci několika parametrů (příprava vzorku, separace, detekce) byly obě metody validovány podle postupu uvedeného v pokynech pro validaci bioanalytických metod z Úřadu pro kontrolu potravin a léčiv (FDA). Následně byly aplikovány na analýzu 2 certifikovaných referenčních materiálů a sady reálných vzorků periprostetických tkání odebraných od pacientů s kloubními náhradami. Stejně jako u předchozí studie byl ve vzorcích nalezen zejména Cr(III) ve volné formě nebo vázaný na pevný podíl. Naopak Cr(VI) nebyl detekován ani v jednom z vybraných vzorků. Avšak v tomto případě byla detailně studována i interkonverze obou specií za využití izotopicky obohacených standardů, kdy byla dokázána 30% redukce Cr(VI) způsobená charakterem matrice tkání. Vzhledem k vyššímu počtu vzorků bylo provedeno detailní statistické vyhodnocení všech dat. Významnou součástí byla i případová studie jednoho pacienta s kloubní náhradou obsahující Cr, jehož výsledky se významně lišily od ostatních. Kromě specií Cr(III) byly v jeho tkáních identifikovány i další formy chromu jako jsou částice a nanočástice nebo Cr vázaný na proteiny.The presented dissertation thesis is focused on development and validation of analytical methods suitable for the chromium speciation analyis in biological samples. Since the application of on-line speciation techniques to biological samples has not been described in detail yet, speciation analyses were performed using two modes of high-performance liquid chromatography (HPLC) in connection with inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS). The theoretical part is dedicated to chromium and mainly its species Cr(III) and Cr(VI) (their toxicokinetics, metabolism and occurrence in biological samples are stated). The next part describes approaches to speciation analysis of chromium, the overview dealing with applications to various biological materials is mentioned as well. The last part deals with the ICP-MS instrumentation, the risk of possible polyatomic interferences associated with the use of this type of detector and with complications with speciation analyses validation. The experimental part is divided into two main areas. The first area is focused on development and validation of speciation analysis using ion-pair reverse phase HPLC in connection with ICP-MS detection and its application to analyses of real blood and joint effusion samples. The whole analytical approach was optimized and validated in terms of linearity, limit of detection, limit of quantification, precision, and trueness. Blood and joint effusion samples coming from patients with implanted chromium-based joint implants were selected for analyses. The obtained results show that Cr(III) is the main specie released into blood as well as joint effusion. In contrast, Cr(VI) was determined in all samples only at trace concentrations. Besides that, the high affinity of Cr(III) to proteins in the sample matrix was confirmed which makes its determination by HPLC-ICP-MS more difficult. All results were statistically compared with control group and significantly higher concentrations of all analytes were found only in the case of joint effusion. Important part was the study of polyatomic interferences negatively affecting determination of chromium by ICP-MS. The second part is devoted to the development and validation of analytical approach utilizing ion-exchange HPLC-ICP-MS and ICP-MS techniques serving for the determination of all chromium forms in biological tissues. After the optimization of several parameters (sample preparation, separation, detection), both methods were validated according to the procedure given in United States Food and Drug Administration (FDA) guideline on the validation of bioanalytical methods. Subsequently they were applied to the analyses of 2 certified reference materials and a set of real periprosthetic tissue samples collected form patients with joint implants. As well as in the previous study, mainly Cr(III) (as free or bound to solid residue) was found in all samples investigated. In contrast, Cr(VI) was not detected in any of selected tissues. However, the interconversion of both species was studied in detail using isotopically enriched standards and the 30% Cr(VI) reduction caused by the nature of sample matrix was proved. Due to the higher number of tissue samples, detailed statistical evaluation of all obtained data was performed. Significant part was the case study of one patient with Cr-based joint implant, whose results differed from the other patients. Besides Cr(III) species, another Cr forms as wear debris particles, nanoparticles, and Cr bound to proteins were identified in selected tissues.