Kyselé fytohormony jsou malé molekuly řídící mnoho fyziologických funkcí v rostlinách. Kvantifikace těchto látek, jejich biosyntetických prekurzorů a metabolitů v rostlinných pletivech přispívá k pochopení biochemických procesů odehrávajících se v rostlinách. V diplomové práci byla pro tuto analýzu zvolena metoda superkritické fluidní chromatografie ve spojení s tandemovou hmotnostní spektrometrií (SFC-MS/MS). Cílem této práce byl vývoj metody SFC-MS/MS pro separaci kyselých fytohormonů s ohledem na citlivost detekce, rozlišení a tvar chromatografických píků. Optimalizace zahrnovala výběr stacionární fáze a složení nástřikového objemu. Pro optimalizaci chromatografických podmínek byl použit komplexní přístup experimentálního návrhu, který zahrnoval vliv těchto faktorů: složení mobilní fáze, výběr aditiv a jejich koncentrace, optimalizace gradientové eluce a dalších parametrů, jako je teplota kolony nebo hodnota zpětného tlaku. V této práci byla vytvořena SFC-MS/MS metoda pro analýzu kyselých fytohormonů. Metoda byla aplikována na stanovení kyselých fytohormonů v mechanicky stresovaných rostlinách Arabidopsis thaliana s cílem ukázat změny jejich hladin v poraněných a vzdálených listech v průběhu času.Acidic phytohormones are small molecules that control many physiological functions in plants. Quantification of these compounds as well as their biosynthetic precursors and metabolites in plant tissues contributes to the understanding of biochemical processes occurring in plants. In diploma thesis, supercritical fluid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (SFC-MS/MS) was chosen for this analysis. The aim of this work was to develop an SFC-MS/MS method for the separation of acidic phytohormones with respect to detection sensitivity, resolution and shape of chromatographic peaks. The optimization included the selection of the stationary phase and the composition of the injection volume. A comprehensive experimental design approach was used to optimize chromatographic conditions, which included the influence of the following factors: mobile phase composition, additive selection and concentration, optimization of gradient elution and other parameters such as column temperature or backpressure value. In this work, an SFC-MS/MS method was developed for the analysis of acidic phytohormones. The method was applied to the determination of acidic phytohormones in mechanically stressed Arabidopsis thaliana plants to show changes in their levels in wounded and distal leaves over time.