Number of the records: 1
Fluorescenční detekce molekulárních interakcí Na+/K+-ATPázy
Title statement Fluorescenční detekce molekulárních interakcí Na+/K+-ATPázy [rukopis] / Kateřina Šmídová Additional Variant Titles Fluorescenční detekce molekulárních interakcí Na+/K+-ATPázy Personal name Šmídová, Kateřina (dissertant) Translated title Fluorescence detection of the Na+/K+-ATPase molecular interactions Issue data 2009 Phys.des. VIII + 59 stran : grafy, tab. Note Ved. práce Martin Kubala Another responsib. Kubala, Martin, 1977- (thesis advisor) Panáček, Aleš, 1978- (opponent) Another responsib. Univerzita Palackého. Katedra experimentální fyziky (degree grantor) Keywords Na+/K+ATPáza * C45 * fluorescein * zhášení fluorescence * TCSPC * heterologní exprese v E.coli * Na+/K+-ATPase * C45 * fluorescein * quenching of fluorescence * TCSPC * heterologous overexpresion in E.Coli Form, Genre diplomové práce master's theses UDC (043)378.2 Country Česko Language čeština Document kind PUBLIKAČNÍ ČINNOST Title Mgr. Degree program Navazující Degree program Fyzika Degreee discipline Biofyzika book
Kvalifikační práce Downloaded Size datum zpřístupnění 54070-247129509.pdf 27 816.4 KB 30.04.2009 Posudek Typ posudku 54070-ved-740361471.doc Posudek vedoucího 54070-opon-509678611.doc Posudek oponenta
Tato práce poskytuje všeobecný přehled o struktuře, funkci a fyziologickém významu sodno-draselné pumpy a dále stručný přehled některých metabolitů a xenobiotik ovlivňujících aktivitu Na+/K+-ATPázy. Cílem této diplomové práce bylo sledovat molekulární interakce Na+/K+-ATPázy s fluoresceinem, proto je zde také věnována kapitola fluoresceinu, jeho chemickým a spektrálním charakteristikám, jeho možnému užití např. v medicíně a také jeho několika analogům, které byly již v souvislosti s Na+/K+-ATPázou zkoumány. Experimenty probíhaly jednak na celé Na+/K+-ATPáze, ale i na její izolované velké cytoplasmatické kličce (C45). Z tohoto důvodu je zde detailněji popsána příprava této kličky, což zahrnuje heterologní expresi v Escherichia coli a následnou purifikaci získaného proteinu. Pro zkoumání interakce mezi fluoresceinem a sodno-draselnou pumpou bylo využito měření kinetiky dohasínání fluorescence metodou korelovaného čítání fotonů (TCSPC) a dále měření zhášení steady-state fluorescence. Výsledky měření zhášení fluorescence nenaznačují, že by zde k vazbě docházelo, ale měření kinetik dohásínání poskytlo výsledky, které danou interakci dokazují. Mimo to výsledky také umožňují rozlišit jednotlivé konformační stavy enzymu v přítomnosti různých ligandů a ukazují na významnou odlišnost konformace enzymu v přítomnosti ATP bez Mg2+. To potvrzuje hypotézy publikované v práci [Gryčová a kol. 2009], které byly vysloveny na základě experimentů s izolovanou velkou cytoplazmatickou kličkou.This thesis provides overall survey of a structure, function and physiological importance of sodium-potassium pump and also a summary of some metabolits and xenobiotics that affect the activity of Na+/K+-ATPase. The aim of this thesis was to study molecular interactions of Na+/K+-ATPase with fluorescein, and therefore there is one chapter focused on the chemical and spectral characteristics of fluorescein and its use in medicine. The chapter also deals with some of the fluorescein analogues that have already been examined in the connection to Na+/K+-ATPase. The experiments were conducted on the entire Na+/K+-ATPase, as well as on its isolated large cytoplasmic segment C45. Therefore preparation of C45 is described in more detail, which involves heterologous overexpresion in Escherichia coli and subsequent purification of the protein. For the examination of fluorescein and sodiumpotassium pump interaction, measurement of the fluorescence decay by the timecorrelated single photon counting (TCSPC) technique and steady-state measurement of the fluorescence quenching were used. The results of steady-state measurement quenching of fluorescence do not prove the binding of the fluorescein to the Na+/K+-ATPase, but the measurement of TCSPC does. Moreover, the results also enable to distinguish individual conformational states of the enzym in the presence of various ligands and indicate a significant distinction of the conformation in the presence of ATP without Mg2+. It confirms hypotheses published in the [Gryčová et al. 2009], which were stated on the basis of experiments with isolated large cytoplasmic segment C45.
Number of the records: 1