Number of the records: 1  

Cytokinin dehydrogenase: heterologous expression, isozyme characteristics and analytical application

  1. Title statementCytokinin dehydrogenase: heterologous expression, isozyme characteristics and analytical application [rukopis] / Marta Kowalska
    Additional Variant TitlesCytokinin dehydrogenase: heterologous expression, isozyme characteristics and analytical application
    Personal name Kowalska, Marta (dissertant)
    Translated titleCytokinin dehydrogenase: heterologous expression, isozyme characteristics and analytical application
    Issue data2010
    Phys.des.84 : il., grafy, schémata, tab.
    NoteVed. práce Ivo Frébort
    Oponent Jozef Šamaj
    Another responsib. Frébort, Ivo, 1965- (thesis advisor)
    Šamaj, Jozef, 1964- (opponent)
    Another responsib. Univerzita Palackého. Katedra biochemie (degree grantor)
    Keywords Cytokinindehydrogenasa * Pichia pastoris * Exprese a purifikace proteinů * His-tag * Sekvenčně-specifický signál pro transport do vakuoly * Fermentor * Biosenzor * Cytokinin dehydrogenase * Pichia pastoris * Protein expression and purification * His-tag * Sequence-specific vacuolar sorting signal * Fermentor * Biosensor
    Form, Genre disertace dissertations
    UDC (043.3)
    CountryČesko
    Languageangličtina
    Document kindPUBLIKAČNÍ ČINNOST
    TitlePh.D.
    Degree programDoktorský
    Degree programBiochemie (čtyřletá)
    Degreee disciplineBiochemistry
    book

    book

    Kvalifikační práceDownloadedSizedatum zpřístupnění
    00125111-801621607.pdf471.8 MB25.11.2010
    Call numberBarcodeLocationSublocationInfo
    DIS/186 (PřF-KBO)3134520562PřF-HolicePřF, Knihovna Holice - skladIn-Library Use Only

    Tato práce se zabývá enzymem cytokinin dehydrogenasa z Arabidopsis thaliana a je rozdělena do čtyř částí. První kapitola uvádí isoenzymy cytokinin dehydrogenasy, jejich strukturu, lokalizaci, vlastnosti a funkce. Druhá část této práce je zaměřena na purifikaci a charakterizaci nesekretovaných isoenzymů. Vakuolární proteiny AtCKX1 a AtCKX3 byly produkovány v kvasince Pichia pastoris a cytosolický enzym AtCKX7 byl získán v expresním systému E. coli. V případě AtCKX1 a AtCKX3 byla odhalena přítomnost N-terminálního sekvenčně-specifického signálu pro transport do vakuoly. Příslušné rekombinantní proteiny byly purifikovány za účelem biochemické charakterizace. Jejich identita byla potvrzena pomocí MALDI-TOF/MS a následně byly stanoveny jejich substrátové specifity a preference pro elektronové akceptory. Ve třetí části práce je popsána produkce apoplastického enzymu AtCKX2. Konstitutivní, extracelulární exprese AtCKX2 byla provedena v kvasinkách Pichia pastoris. Rekombinantní protein byl označen histidinovou kotvou následovně: na C-konci, na N-konci a na obou koncích za účelem usnadnění purifikace a byl určen vliv histidinových fúzi na enzymovou aktivitu. Dále byla zavedena exprese ve velkém měřítku, v 15-i litrovém fermentoru, s použitím glycerolu a glukózy, jako zdrojů uhlíku. V poslední kapitole je popsán vývoj cytokininového biosenzoru s využitím rekombinantního enzymu AtCKX2.This work deals with cytokinin dehydrogenase enzymes from Arabidopsis thaliana and consists of four parts. The first chapter is an introduction to cytokinin dehydrogenase enzymes, their structure, localization, properties and functions. The second part of this work is focused on the purification and characterization of non-secreted AtCKX isozymes. Vacuolar proteins AtCKX1 and AtCKX3 were produced in Pichia pastoris and cytosolic enzyme AtCKX7 was obtained from Escherichia coli expression system. In the case of AtCKX1 and AtCKX3 the presence of N-terminal sequence-specific vacuolar sorting signal was revealed. Respective recombinant proteins were purified for their biochemical characterization. With the use of MALDI-TOF/MS the enzymes were identified and subsequently their substrate specificity and electron acceptor preference was determined. In the third part of the work the production of an apoplastic enzyme AtCKX2 is described. The constitutive extracellular expression of AtCKX2 was carried out in Pichia pastoris. Recombinant protein was fused with His-tag domain on its C-terminus, N-terminus and on both termini in order to facilitate purification and the influence of such fusions on enzyme?s activity was determined. Further, large-scale expression in 15 litres fermentor was established with glycerol and glucose as the carbon source. The last chapter describes the development of cytokinin biosensor with the use of recombinant AtCKX2 enzyme.

Number of the records: 1  

  This site uses cookies to make them easier to browse. Learn more about how we use cookies.