Disertační práce se zabývá studiem rychlých separací ve spojení s hmotnostní spektrometrií se zaměřením na analýzu nových psychoaktivních látek a oligosacharidů. Teoretická část je věnována rychlým chromatografickým separacím a separacím iontovou mobilitou ve spojení s hmotnostní spektrometrií včetně jejich praktických aplikací. Jsou zde rovněž popsány postupy umožňující odlišení nedostatečně separovaných mobilitních píků. Teoretickou část uzavírají kapitoly zabývající se novými psychoaktivními látkami (NPS) a kyselinou hyaluronovou. Výsledky práce zahrnují studium a validaci chromatografické separace 15 NPS ze skupiny katinonů a fenylethylaminů v moči pomocí ultra-vysokoúčinné kapalinové chromatografie (UHPLC) a ultra-vysokoúčinné superkritické fluidní chromatografie (UHPSFC). K úpravě vzorků moče byl použit jednoduchý postup "zředit-zfiltrovat-analyzovat". Z hlediska výtěžnosti i matričních efektů poskytovala UHPSFC kompaktnější výsledky, avšak na vyšších koncentračních hladinách docházelo k přenosu analytu do následující analýzy. Tento jev lze minimalizovat proložením analytické sekvence slepými vzorky. Při separaci izomerů NPS bylo dosaženo lepších výsledků technikou UHPSFC, která oproti UHPLC umožnila úspěšně rozlišit izomery 3-FMC a 4-FMC. Pro všech 15 NPS byly stanoveny limity detekce a kvantifikace, přičemž limity detekce se pohybovaly v rozmezí 0,01 až 5 ng/ml moče. Kromě chromatografické separace byly nové psychoaktivní látky analyzovány pomocí iontové mobility ve spojení s hmotnostní detekcí. Vedle testování vlivu druhu driftového plynu na iontově mobilitní separaci byly vypočteny hodnoty CCS (účinného srážkového průřezu), které jsou další charakteristikou látky vhodnou pro potvrzení její identifikace. V souvislosti s menší rozlišovací schopností iontové mobility byl vyvinut jednoduchý postup k určení ploch nedostatečně separovaných mobilitních píků, který vychází z předpokladu dobré opakovatelnosti driftového času a tvaru mobilitního píku (ATD profilu). Profil mobilitního píku je popsán jednou nebo více Gaussovskými funkcemi, z nichž je pro jednotlivé složky v binárních směsích získána tzv. ATD funkce. Tyto ATD funkce byly aplikovány na iontově mobilitní data modelových směsí oligosacharidů odvozených od kyseliny hyaluronové. Plochy píků jednotlivých složek získané fitováním dobře korelovaly s hodnotami, které byly získány integrací HPLC píků. Navržený postup se může uplatnit nejen při analýze oligosacharidů, ale také u dalších analytů špatně separovaných iontovou mobilitou. Dosažené výsledky ukazují význam rychlých separací při analýze toxikologicky nebo biologicky zajímavých látek.The dissertation deals with rapid separations coupled to mass spectrometry with the focus on analysis of new psychoactive substances and oligosaccharides. The theoretical part is devoted to fast chromatographic separations and separations by ion mobility spectrometry coupled to mass spectrometry, including their practical applications. Procedures allowing for distinguishing poorly separated mobility peaks are also described. The theoretical part is concluded by the chapters dealing with new psychoactive substances (NPS) and hyaluronic acid. The results include the development and validation of chromatographic separation of 15 NPS (cathinones and phenylethylamines) in urine based on ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) and ultra-high performance supercritical fluid chromatography (UHPSFC). A simple "dilute-filter-and-shoot" procedure was used to treat urine samples. UHPSFC provided more uniform results in terms of recovery and matrix effects, but carryover of certain analytes was observed at higher concentration levels. This phenomenon can be reduced sufficiently by inserting blank samples into the analytical sequence. Regarding the separation of NPS isomers, better results were obtained by the UHPSFC that allowed for successful differentiation of 3-FMC and 4-FMC isomers, as opposed to UHPLC. Limits of detection and quantification were determined and LOD in the range from 0.01 to 5 ng/mL urine was observed. Besides chromatographic separation, new psychoactive substances were analyzed using ion mobility coupled to mass detection. In addition to testing the influence of the drift gas on the ion mobility separation, the CCS (collision cross section) values were also measured. CCS represents another characteristic suitable for confirming the identity of the substance. Due to the lower resolving power of ion mobility, a simple procedure has been developed to determine areas of insufficiently separated mobility peaks, based on the assumption of good repeatability of drift time and peak shape (ATD profile). The mobility peak profile is described by one or more Gaussian functions, from which ATD functions are obtained for the individual components of the binary mixtures. These ATD functions were applied to the ion mobility data of model mixtures of hyaluronic acid-derived oligosaccharides. The peak areas of the individual components obtained by fitting correlated well with the values got integrating HPLC peaks. ATD functions might be useful not only for analysis of oligosaccharides but also for other analytes poorly separated by ion mobility. The achieved results demonstrate the importance of rapid separations for analysis of toxicologically or biologically relevant substances.