Cílem diplomové práce bylo vyvinout jednoduchou metodu pro identifikaci a stanovení vybraných farmaceutických substancí ze skupiny perorálních antidiabetických léčiv v klinických vzorcích krevní plazmy. Bylo zvoleno pět v České republice nejužívanějších perorálních antidiabetik (metformin, glimepirid, gliklazid, glibenklamid a sitagliptin). Tato antidiabetika slouží k léčbě cukrovky 2. typu (diabetes mellitus 2. typu), při níž pacienti trpí nedostatečnou citlivostí tkání na inzulín. Příprava vzorku byla provedena precipitací proteinů krevní plazmy. Vzhledem k významné odlišnosti fyzikálně-chemických vlastností metforminu od ostatních analytů byly pro separaci použity dvě různé stacionární fáze. Celková doba separace byla 7,5 minuty. Identifikace látek byla provedena stanovením přesné a správné hmoty pomocí hmotnostního spektrometru s ionizací elektrosprejem a hybridním analyzátorem QqToF a srovnáním MS/MS spekter se standardy, pro něž byly navrženy fragmentační mechanismy. Kvantifikace byla provedena na základě kalibrační křivky sestrojené s použitím izotopově značených standardů. Součástí práce byla i aplikace vyvinuté metody na reálné vzorky krevní plazmy pacientů léčených perorálními antidiabetiky.The thesis aimed to develop a simple method for identification and determination of chosen pharmaceutical substances with antidiabetic activity in clinical plasma samples. Five of the most used peroral antidiabetics in the Czech Republic were chosen: metformin, glimepiride, gliclazide, glibenclamide and sitagliptin. These antidiabetics are used to treat type 2 diabetes mellitus which is caused by insufficient tissue sensitivity to insulin. The samples were prepared by precipitation of the blood plasma proteins with acetonitrile. As metformin is significantly different from the other analytes in its physicochemical properties, two different stationary phases were used for the separation process. The total separation time was 7.5 minutes. Using a QqTOF mass spectrometer with electrospray ionization, the analytes were identified by determination of their accurate mass and by comparison of MS/MS spectra with those of standards. The quantitation was based on calibration curves that were created using isotopically labeled internal standards. The method was also applied to real blood samples obtained from patients on antidiabetic medication.