Dvojrozměrná plynová chromatografie s hmotnostně spektrometrickou detekcí umožňuje analýzu vysoce komplexních vzorků, mezi které patří i lidská moč. Nezbytnou součástí úspěšné separace jsou vhodně zvolené podmínky, při kterých analýza probíhá. Tyto podmínky se liší nejen pro každý typ vzorku, ale i pro jednotlivé analyty. Předložená práce se zabývá metabolomickou analýzou silylovaných metabolitů lidské moči. Optimalizační vzorek moči je analyzován na různých kolonových uspořádáních, které se liší polaritou, tloušťkou vrstvy stacionární fáze a vnitřním průměrem kolon. Porovnávána jsou tato kolonová uspořádání: BPX5/SolGel-WAX, BPX5/SLB-IL59, BPX50/SolGel WAX, BPX50/BPX5, SolGel-WAX/BPX5, SLB-IL59/BPX50. U jednotlivých setů je hodnocena ortogonalita a na jejím základě je stanoveno nejlepší kolonové uspořádání BPX5/SolGel-WAX. Toto kolonové upořádání je použito pro analýzu vzorků zdravých dětí a pacientů s glutarovou acidurií.Two-dimensional gas chromatography with mass spectrometry detection allows us to analyze very complex samples. Appropriate conditions of analysis play a key role in successful separation. For every type of sample and each analyte there are unique conditions. This work is dealing with metabolomic analysis of urine sample. Silylation agent is used for derivatization. Urine sample used for optimization is analyzed by different column sets with varied polarity, width of stationary phase and internal diameter of column. BPX5/SolGel-WAX, BPX5/SLB-IL59, BPX50/SolGel-WAX, BPX50/BPX5, SolGel-WAX/BPX5, SLB-IL59/BPX50 are columns used for analysis in this work and compared. Separation success is characterized by orthogonality. Column combination BPX5/SolGel-WAX was determined as the best. This combination is used for urine sample analysis of healthy children and patients with glutaric aciduria.