Kolomazníková, Veronika
Exprese lidského alfa-3 beta-1 komplexu Na+/K+-ATPasy v kvasinkách Saccharomyces cerevisiae [rukopis] / Veronika Kolomazníková. -- 2017. -- 65. -- Ved. práce Jaroslava Šeflová. -- Oponent Miroslav Huličiak. -- Abstrakt: Cílem této bakalářské práce byla příprava lidského komplexu alfa-3 beta-1 Na+/K+-ATPasy v kvasinkách Sa-charomyces cerevisie. Na+/K+-ATPasa byla úspěšně připraven jako fúzní protein s histidinovou kotvou na N-konci podjednotky beta. Důležitými faktory pro pří-pravu membránových proteinů je složení kultivačního média, rozrušení buněčné membrány detergenty a doba solubilizace membrán. Jako účinnější se ukázala solubilizace 2 hodiny pomocí detergentů SDS a DDM. Nicméně, využití afinitní chromatografie vedlo ke značným ztrátám podjednotky alfa. Jako vhodnější metoda se ukázala purifikace s využitím diferenciální centrifugace založená na protokolu izolace Na+/K+-ATPasy z vepřových ledvin. Při úspěšné přípravě lidského alfa-3 beta-1 komplexu Na+/K+-ATPasy v aktivním stavu je možné studovat strukturní změny způsobené mutacemi v genu ATP1A3 kódující isoformu alfa-3, jejíž mutace zapříčiňují několik neurologických poruch.. -- Abstrakt: We expressed the human complex alpha-3 beta-1 of Na+/K+-ATPase in yeast cells Saccharomyces cerevisiae. The recombinant protein was expressed as the His-tag fusion protein, which was localised on the N-terminus of beta subunit. A crucial step in the purification of membrane proteins is their solubilisation with detergents. We identified the suitable detergents (malto-sides and SDS) and the incubation time for membrane solubilisation. Moreover, the considerable losses of the alpha subunit occurred during the affinity chromatography. According to these findings we decided to change the purification procedure. We used the analogous protocol for the isolation of the porcine kidney Na+/K+-ATPase. The preparation of Na+/K+-ATPase in yeast can be useful for the studies of mutation effects on the enzyme structure.
Šeflová, Jaroslava. Huličiak, Miroslav. Univerzita Palackého. Centrum regionu Haná
Sodno-draselná pumpa. exprese. kvasinky. neurologické poruchy. Sodium-potasium pump. expression. yeast. neurologi-cal disorders. bakalářské práce
(043)378.22