Tiotropium bromid je bronchodilatans užívané jako léčivo nemocí spojených s obstrukcí dýchacích cest jako je astma nebo chronická obstrukční plicní nemoc. Je to selektivní, kompetitivní, reverzibilní antagonista muskarinových receptorů s ultra-dlouhodobým účinkem. Při podání tiotropia nedochází k výrazné biotransformaci a velká část tiotropia je vyloučena v nezměněné formě. Cílem práce bylo zavedení LC/MS metody pro stanovení tiotropia v biologických vzorcích, konkrétně v moči. Práce obsahuje literární rešerši na téma tiotropium, HPLC, hmotnostní spektrometrie a validace. Experimentální část popisuje volbu podmínek analýzy, přípravu vzorku, kalibraci a validaci metody. Následně byly změřeny biologické vzorky od jednoho pacienta. Srážení acetonitrilem a následná SPE extrakce pomocí SCX kolonek byla zvolena jako nejlepší úprava vzorku. Pro HPLC analýzu byla použita kolona Luna SCX (150 × 3 mm, s částicemi 5 ?m) a separace probíhala isokraticky. Jako mobilní fáze byl použit 30mM mravenčan amonný s pH 4 ve směsi s acetonitrilem v poměru 20:80. Zavedená metoda splňuje parametry validace a umožňuje tak spolehlivě stanovit koncentraci tiotropia v moči u pacientů.Tiotropium bromide is a bronchodilator used as a drug to treat of diseases associated with airway obstruction like asthma or chronic obstructive pulmonary disease. It is the selective, competitive, reversible muscarinic receptor antagonist with ultra-long-lasting effect. Administered tiotropium is not significantly biotransformed and a large portion is eliminated in unchanged form. The aim of the thesis was to develop the LC/MS method for tiotropium determination in biological samples, specifically in urine. The thesis contains a review on topics of tiotropium, HPLC, mass spectrometry, and validation. Experimental part describes the choice of analysis conditions, sample preparation, calibration, and validation of the method. Subsequently, biological samples from one patient were measured. For sample preparation, acetonitrile precipitation followed by SPE extraction on SCX columns was chosen as the best. For HPLC analysis, the Luna SCX column (150 × 3 mm, with 5 ?m particles) was used and the separation was isocratic. The solution of 30mM ammonium formate with pH of 4 mixed with acetonitrile in a ratio 20:80 was used as the mobile phase. The established method meets the validation parameters and thus enables reliable determination of the concentration of tiotropium in the urine of patients.