Žilić, Selma
Purifikace rekombinantních proteinů z kvasinkového expresního systému [rukopis] / Selma Žilić. -- 2010. -- -65- : il., grafy, schémata, tab. -- Ved. práce Ivo Frébort. -- Abstrakt: Cílem předkládané diplomové práce byla studie exprese a purifikace enzymu cytokinindehydrogenasy (CKX, EC 1.5.99.12). Prvním krokem bylo naklonování vybraného genu (AtCKX2) do vhodného expresního systému. Gen byl exprimován ve kvasince Pichia pastoris pomocí expresního vektoru pPIC9K umožňujícího integraci genu ve více kopiích. Již dříve byly u P. pastoris popsány případy zvýšení exprese požadovaného genu pomocí tohoto systému. Vektor pPIC9K umožňuje izolaci transformantů s různým počtem insertů za účelem ověření, zda vyšší počet kopií rekombinantního genu zároveň vede ke zvýšení exprese proteinu. Výsledná úroveň exprese se u jednotlivých klonů obsahujících několik kopií rekombinantního genu lišila. Výsledky screeningu aktivity enzymu u jednotlivých klonů ukázaly 2,5-krát vyšší aktivitu v porovnání s referenčním klonem, jenž exprimoval stejný protein pomocí vektoru pGAPZaA zajišťujícího integraci pouze jedné kopie genu. Rekombinantní proteiny byly navrženy tak, že obsahovaly histidinovou kotvu na různých místech v sekvenci. Proteiny byly purifikovány pomocí různých chromatografických metod - chromatografie na základě hydrofobních interakcí (HIC) - Octyl Sepharosa, iontoměničové chromatografie - High Q Sepharosa a afinitní chromatografie - Ni-NTA Sepharosa, identifikovány pomocí SDS-PAGE a MALDI-TOF a též byly porovnány jejich aktivity.. -- Abstrakt: In presented diploma thesis, the expression and purification of the enzyme cytokinin dehydrogenase (CKX, EC 1.5.99.12) was studied. The first step in the protein expression involved specific cloning of the target gene (AtCKX2) into an appropriate expression vector. The gene was expressed in the Pichia pastoris expression system in the pPIC9K vector allowing multicopy gene integration. Multiple copy integration of recombinant genes in Pichia pastoris has been previously demonstrated to increase expression of the desired gene in some cases. The vector pPIC9K allows isolation of transformants with different number of inserts, in order to test whether increasing the copy number of your recombinant gene will lead to a subsequent increase in secreted protein expression. The results considering increased expression in clones with multiple copy integration of recombinant genes were diverse. Screening of the enzyme activity for clones with multiple copy integrations indicated 2.5 times higher activity when compared with the activity of the same protein expressed in the pGAPZA vector (a reference clone with single gene integration). Recombinant proteins were designed to contain polyhistidine tags with different locations in the protein sequence. Proteins were purified with different chromatography methods - hydrophobic interaction chromatography (HIC) - Octyl Sepharose, ion-exchange chromatography - High Q Sepharose and affinity chromatography - Ni-NTA Sepharose, identified with SDS-PAGE and MALDI-TOF methods and their enzyme activity compared.
Frébort, Ivo, 1965-. Šebela, Marek, 1971-. Univerzita Palackého. Katedra biochemie
Pichia pastoris. exprese proteinů. cytokinindehydrogenasa. vícenásobné vložení genu. Pichia pastoris. protein expression. cytokinin dehydrogenase. multiple gene insertion. diplomové práce
(043)378.2