Tato práce se zaměřuje na zavedení metod chemické analýzy medu s důrazem na studium sekundárních metabolitů rostlin. Jedním z hlavních cílů bylo osvojení metod fyzikálně-chemické analýzy (stanovení obsahu vody, elektrické vodivosti, volné acidity, prolinu apod.). Bylo analyzováno široké spektrum medů různého druhu a původu. Dalším cílem práce bylo navržení metody pro separaci fenolových kyselin a flavonoidů pomocí HPLC a jejich následná identifikace a kvantifikace pomocí spojení HPLC-ESI-MS a UHPLC-MS/MS. Důraz byl především kladen na stanovení fenolového a flavonoidního profilu u jednodruhových medů. Dále byla identifikována druhová příslušnost jednodruhových medů na základě pylové analýzy. Zvláštní pozornost byla věnována určení druhu pylových zrn v květovém medu z ostropestřce mariánského (Silybum marianum. Spojení HPLC-ESI-MS a pylová analýza byly posléze využity pro stanovení biooaktivních látek v květovém medu z ostropestřce mariánského, které med neobsahoval.This work is focuses on the introduction of methods of chemical analysis of honey with an emphasis on the study of plant secondary metabolites. One of the main goal was to adopt the methods of physico-chemical analysis (determination of water content, electrical conductivity, free acidity, proline etc.). Wide range of honeys of different kind and origin were analyzed. Another aim was to design a method for the separation of phenolic acids and flavonoids by HPLC and their subsequent identification and quantification using by connection HPLC-ESI-MS and UHPLC-MS/MS. Emphasis was placed especially on the determination of phenol and flavonoids in monofloral honey. Further, the identification of plant species in monofloral honeys was based on microscopic analysis of pollen grains. Special attention was paid to identifying the type of pollen grains in honey from milk thistle (Silybum marianum). Combination HPLC-ESI-MS and pollen analysis were used to determine the bioactive substances in milk thistle honey, which were not contain in honey.