Abstrakt Vitamíny rozpustné v tucích jsou kritické mikronutrienty pro živočichy včetně lidí. Existují čtyři hlavní skupiny vitamínů rozpustných v tucích: A, D, E a K. Vzhledem k charakteristikám vitamínů rozpustných v tucích je důležité stanovit jejich koncentrace v organismu. Avšak je obtížné stanovit všechny v jedné analýze. Pro tuto studii byly vybrány hlavní formy každé skupiny vitamínů: retinol, alfa tokoferol, cholekalciferol, kalcidiol a fylochinon. Cíle práce se zaměřovaly na získání potřebných informací k vývoji a metody na analýzu vitamínů rozpustných v tucích a jejich následnou validaci. Vývoj metody začal s extrakcí pomocí methanolu, elucí LC gradientu využívá mobilní fáze: (A) Methanol/voda (50/50, v/v) + 0.2% kyselina mravenčí a (B) methanol + 0.2% kyselina mravenčí a detekcí pomocí hmotnostního spektrometru s analýzou pomocí orbitální pasti. Jednofázová extrakce však nebyla dostatečně účinná, přistoupilo se tedy k dvoufázové extrakci pomocí směsi hexanu a chloroformu (90/10, v/v), která byla efektivnější. Avšak analýza orbitální pastí nebyla dostatečně senzitivní pro detekci všech vybraných vitamínů rozpustných v tucích, tedy byla MS detekce přesunuta na kvadrupólový hmotnostní spektrometr s použitím "Multiple reaction monitoring (MRM)". Příprava vzorku byla optimalizovaná. Finální metoda byla validovaná pro vitamíny A a E pomocí norem evropské medicínské agentury. (EMA)Fat-soluble vitamins (FSVs) are crucial micronutrients for animals, including humans. Four main FSVs groups exist: A, D, E and K. Due to the nature of FSVs, it is essential to determine the concentrations in the organism, but at the same time, it is challenging to analyse all of the FSVs in one analysis. For this study, only the main forms of each FSV were selected: retinol, alpha-tocopherol, cholecalciferol, calcidiol and phylloquinone. The aims of the work were focused on obtaining the necessary background for the development of the assay analysing FSVs and their following validation. The assay development started with the extraction using methanol and LC gradient elution applying mobile phases (A) Methanol/water (50/50, v/v) + 0.2% formic acid and (B) methanol + 0.2% formic acid with detection on orbitrap mass spectrometer. The monophasic extraction was not efficient enough. Therefore, biphasic extraction was introduced using a mixture of hexane and chloroform (90/10, v/v), which was the most effective. However, the orbitrap was not sensitive enough to detect all selected FSVs; thus, the MS detection was switched to triple quadrupole (QQQ), applying multiple reaction monitoring (MRM). The sample preparation was modified to obtain better results. The final assay for vitamins A and E was validated according to the European medical agency (EMA) guidelines.