Poměrové fluorescenční zobrazování uvnitř buněk a systémy pro doručování léků představují v současné medicinální chemii a terapii zajímavou strategii zejména pro její osobní přístup a detailnější studium penetrace a lokalizace léků v buňkách s využitím nedestruktivních technik. Řízené a cílené doručování léků a monitorování jejich uvolňování v reálném čase má velký význam kvůli snížení nebo zmírnění nežádoucích vedlejších účinků v procesu léčby. V první části této disertační práce je diskutován design, syntéza a spektrální vlastnosti fluorescenčních konjugátů BODIPY a 3-hydroxychinolonů. První generace těchto látek zahrnuje konjugáty BODIPY-3HQ spojené disulfidovým linkerem, aby se umožnilo štěpení díky zvýšené koncentraci glutathionu. Druhá generace konjugátů byla vybavena buď dvěma fluorescenčními barvivy umožňujícími FRET poměrovou detekci nebo jednou fluorescenční značkou a cílící jednotkou tak, aby byla umožněna selektivní lokalizace v rakovinných buňkách. Aktivita obou generací konjugátů byla studována na buněčných liniích za použití fluorescenční mikroskopie. Druhá část disertační práce je věnována popisu designu, syntézy a optimalizace nové tří-fluoroforové duální-FRET sondy pro detekci a kvantifikaci proteolytických enzymů - kaspázy-8 a kaspázy-9. Sonda byla navržena jako poměrová s jednou excitací a trojitou emisi, které se mění během enzymatického štěpení specifických linkerů. Testované sondy byly připraveny syntézou na pevné fázi a byl vyvinut matematický model pro jednoznačnou detekci obou kaspáz samostatně nebo ve směsi a pro stanovení jejich relativní aktivity. Funkčnost navrhovaného systému byla testována v biologickém médiu, konkrétně na buněčných lyzátech se selektivně aktivovanými kaspázami -8 a -9.Ratiometric fluorescent intracellular imaging and drug delivery represent interesting strategy in current medicinal chemistry and study of various therapeutics for its personalized approach and deeper study of drug penetration and localization in cells taking advantage mainly of being non-destructive technique. Controlled and targeted delivery and real-time monitoring of drug release is of great importance due to reducing or lessening of adverse side effects in process of medication. In the first part of this thesis, the design, synthesis and spectral properties of fluorescent conjugates of BODIPY and 3-hydroxyquinolinones (3HQs) are discussed. First generation involves BODIPY-3HQ conjugates connected with disulfide linker allowing a cleavage by increased level of glutathione. Second generation of conjugates were equipped either with two fluorescent dyes to allowing the FRET ratiometric detection or with one fluorescent tag and targeting unit to provide selective localization in the cancer cells. Both generations of conjugates were studied with respect to biological activity and fluorescent properties. The second part is dedicated to description of design, synthesis and optimization of novel fluorescent three-fluorophore dual-FRET peptide probe for detection and quantification of proteolytic enzymes - caspase 8 and caspase 9. The probe was designed as a ratiometric single-excitation triple-emission system which function is driven by a change of fluorescence intensities during the enzymatic cleavage of specific linkers. Several probes were prepared by solid-phase chemistry approach and mathematical model for unambiguous caspases detection and determination of their relative activities was developed. The functionality of proposed system was tested in biological media, specifically on cell lysates with selectively activated caspase-8 and caspase-9.