Cílem předkládané dizertační práce bylo charakterizovat proteom různých biologických matric s využitím proteomických metod. Zaměřili jsme se zejména na proteomické přístupy pro navržení a validaci biomarkerů různých onemocnění. Stěžejní část této práce tvoří hmotnostně spektrometrické metody, ale i metody založené na elektroforéze. Byl popsán proces hledání biomarkerů a byly zmíněny okolnosti komplikující tento proces. Biomarkery mohou být identifikovány v mnoha různých biologických matricích a snahou je využívat takový biologický materiál, jenž je možné odebrat neinvazivně. V případě zavedení nového biomarkeru do klinické praxe může neinvazivní způsob odběru usnadnit vyšetření a diagnostiku řady onemocnění a odběr vzorku bude pro pacienta méně zatěžující než invazivní odběr. Za slibnou biologickou matricí pro neinvazivní diagnostiku respiračních a systémových onemocnění je považován i kondenzát vydechovaného vzduchu (EBC). Ten byl v práci detailně popsán a dále studován. Biomarkery buněčné odpovědi na léčbu jsou také chápány jako biomarkery toxicity a účinků léčiva. Tyto biomarkery je důležité identifikovat pro pochopení mechanismu účinku daného léčiva a jsou popsány také metody, jak je hledat a identifikovat. V experimentální části práce byl zaveden nový přístup pro detailní a vysoce reprodukovatelnou charakterizaci proteomu EBC. Tento přístup využívá hmotnostní spektrometrii o vysokém rozlišení a zpracování vzorku bez předchozí elektroforetické separace. Vzhledem k tomu, že EBC je proximální tekutinou plic a dýchacích cest, může být využíván pro úspěšnou detekci biomarkerů plicních onemocnění a respiračního traktu. V naší práci byly popsány změny v proteinovém profilu EBC v závislosti na věku u zdravých dětí a dospělých jedinců. Předpokládá se, že proteiny, které byly rozdílně exprimovány v EBC jedinců různých věkových kategorií, jsou prediktivními biomarkery onemocnění spojených s věkem a s rezistencí, případně s vnímavostí k některým onemocněním. Ve druhé kapitole experimentální části práce jsou popsány proteomické metody pro validaci biomarkerů. Buněčná odpověď na ošetření oxaliplatinou byla analyzována pomocí proteomického profilování založeného na hmotnostní spektrometrii. Identifikované biomarkery buněčné odpovědi na léčbu byly úspěšně validovány metodou Western blot. Dále byla zavedena metoda DARTS (Drug Affinity Responsive Target Stability), která se ukázala být velice užitečnou pro validaci biomarkerů. Tato metoda byla použita pro potvrzení skutečnosti, že protein NPL4 je molekulárním cílem disulfiramu (Antabus), pokud se toto léčivo, dříve předepisované k léčbě závislosti na alkoholu, využije pro terapii rakoviny.This thesis aimed to characterize the proteome of various biological matrices using proteomic methods. We have focused mainly on proteomic approaches to design and validate biomarkers of multiple diseases. Mass spectrometric methods and methods based on electrophoresis play a crucial role in this thesis. We have characterized the process of discovering biomarkers, and the difficulties in this process were mentioned. Biomarkers of diseases could be searched in many biological matrices, and there is a need to look for non-invasively taken ones. Once introduced into clinics, non-invasive diagnostics would facilitate the investigation and diagnosis of many diseases and for patients, make sampling less burdening than the current invasive methods. Exhaled breath condensate (EBC) was selected to be described and further studied as a promising matrix that is collected non-invasively and is suitable for detecting biomarkers of various respiratory and systemic diseases. Biomarkers of response to treatment could be so-called biomarkers of drug toxicity and efficacy, and it is necessary to identify them to understand the mechanism of drug action. Ways to search for and identify these biomarkers have also been described. In the experimental part, a gel-free mass spectrometry approach was used for in-depth characterization of the EBC proteome with high reproducibility. This approach includes high resolution mass spectrometry and gel-free sample processing. Because EBC is the body fluid proximal to lung and airways, it could be successfully used to detect biomarkers of lung and other respiratory diseases. In our work, the age-related changes in protein profiles of EBC have been reported in healthy children and adults. It has been suggested that proteins that are differentially expressed in different age groups are predictive markers of age-related diseases and resistance or susceptibility to certain diseases. In the second part of the experimental work, proteomic methods for the biomarker validation were implemented. The cellular response to oxaliplatin treatment was assessed by mass spectrometry-based proteome profiling. The identified biomarkers of this cellular response were successfully validated by Western blot. Furthermore, the Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) method is useful in the biomarker validation. It has been used to confirm that the NPL4 protein is a molecular target of the old alcohol aversion drug disulfiram (Antabuse) when used to treat cancer.