Tato práce je zaměřena na identifikaci cílů protinádorových léčiv. V teoretické části jsou popsány metody, které se k odhalení cílů a mechanismů účinků léčiv používají. Experimentální část je rozdělena do dvou částí podle dvou projektů. První projekt se zabývá identifikací molekulárního cíle chinolonových derivátů. Využívali jsme zde metody afinitní purifikace spojené s hmotnostní spektrometrií pro identifikaci cílů, dále pro validaci jsme použili enzymatické eseje, analýzu metabolitů a izotermální titrační miktokalorimetrii. Podařilo se nám identifikovat molekulární cíl elongační faktor 1 alfa 1 a objasnit dopady léčby touto látkou na buněčné mechanismy. Druhým projektem je identifikace molekulárního mechanismu nukleosidového analoga AB61. Cílem bylo zjistit, který proces tato molekula cílí a jaký je mechanismus účinku. Zjistili jsme, že studovaná látka AB61 není účinně fosforylována ve fibroblastech, na rozdíl od nádorových buněk. Dále jsme potvrdili, že templátová RNA s inkorporovaným cytostatikem inhibuje translaci. Při studii jsme použili metody hmotnostní spektrometrie spojené s UPLC a analýzu protoesyntézy.The thesis is focused on identification of targets of two selected anticancer compounds. In the theoretical part, methods used for drug target identification are described. Experimental part is divided into two parts corresponding to two projects. The first project is focused on identification of molecular target of quinolone derivatives. We have used affinity purification coupled to mass spectrometry for identification. Further, we have used enzymatic assays, metabolite analysis and isothermal titration microcalorimetry for validation. We have succeeded in identification of the elongation factor 1 alpha 1 as the molecular target of compound 3 and explain how these compound affect cell mechanisms. The second project was focused on identification of molecular mechanism of AB61 nucleoside analogue. The aim was to find the target process that is affected by the compound and describe the mechanism of its action. We have found inefficient phosphorylation of AB61 in fibroblasts compared to cancer cells. Further, we have described that template RNA with incorporated cytostatic inhibits translation. We have used mass spectrometry coupled to UPLC and analysis of proteosynthesis for this purpose.