Enzymopatie, genetické onemocnění vyznačující se vrozenými abnormalitami enzymů červených krvinek, jsou jednou z příčin vzniku vrozené nesferocytární hemolytické anémie (HNSHA). Mezi nejrozšířenější z nich patří defekt glukosa-6-fosfátdehydrogenasy (G6PD) a pyruvátkinasy (PK). Základní diagnostické testy sice umožňují určit pravděpodobnou příčinu anémie, ale nejsou schopny rozlišit jednotlivé enzymovýmé defekty. Přesná diagnóza je tak určena až na základě snížené aktivity daného enzymu s následnou molekulárně-genetickou analýzou. Zavedli jsme screeningové metody, které mohou přispět k rozlišení mezi jednotlivými skupinami enzymopatií vedoucími k hemolytické anémii (HA). Tyto metody zahrnují stanovení koncentrace oxidovaného a redukovaného glutathionu (defekt glutathionového metabolismu erytrocytu), ADP a ATP (nedostačující glykolýza) prostřednictvím HPLC-MS/MS a spektrofotometrického stanovení poměru pyrimidinových a purinových bází určujícího deficit enzymu pyrimidin-5´-nukleotidasy. Dále jsme zoptimalizovali metodiky stanovení aktivity 11 enzymů, jejichž defekt může vést k HNSHA s různou četností výskytu. Analýzy byly aplikovány u 12 pacientů s podezřením na HA způsobenou erytrocytární enzymopatií. U 5 pacientů byla prokázána snížená aktivita PK (nedostatečnost glykolýzy se projevila rovněž sníženým poměrem ATP/ADP) a u 2 snížená aktivita G6PD. Diagnóza byla definitivně potvrzena prokázáním kauzální mutace v genu PKLR (1594C>T, 1529G>A, 1456C>T, 878A>T) a G6PD (647T>A, G844C). Mutace 878A>T a 647T>A nebyly dosud v literatuře popsány.Hereditary nonspherocytic hemolytic anemias (HNSHA) are associated with specific erythrocyte enzymopathies, which are defined as genetic disorders characterised by inherited abnormality of one of erythrocyte enzymes. The most common enzymopathies are glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) and pyruvate kinase (PK) deficiencies. Routine diagnostic tests enable to determine a presumable cause of anemia but do not distinguish among enzyme defects. It is only the direct enzyme activity assay followed by molecular genetic characterisation that allow diagnosis of erythroenzymopathies. We established screening methods such as HPLC-MS/MS determination of reduced and oxidised glutathione or ADP and ATP concentrations, which are useful for identification of either glutathione metabolism or glycolysis enzymopathies, and spectrophotometric monitoring of purine and pyrimidine erythrocyte pools, which characterise pyrimidine-5´-nucleotidase deficiency. Further, we optimised enzyme activity assays for characterisation of 11 enzyme defects leading to HNSHA with different frequency. We analysed 12 patients with suspected enzymopathies causing hemolytic anemia. Five patients had low PK activity with decreased ATP/ADP ratio (insufficient glycolysis) and two patients had reduced G6PD activity. The diagnosis (enzyme deficiency) was finally confirmed by identification of mutations in PKLR (1594C>T, 1529G>A, 1456C>T, 878A>T) and G6PD genes (647T>A, G844C). Mutations 878A>T and 647T>A have not yet been reported in the literature.